izoelektrická fokusácia

izoelektrická fokusácia, izoelektrické zaostrovanie — elektroforetická technika separácie amfolytov (amfiónov) podľa hodnôt ich izoelektrických bodov pôsobením elektrického poľa pozdĺž gradientu pH vytvoreného v géloch v tenkej vrstve alebo v kapiláre (→ elektroforéza). Technika izoelektrickej fokusácie patrí k rovnovážnym technikám, kinetický proces iba určuje rýchlosť dosiahnutia rovnováhy. Separácia amfiónov (obsahujú súčasne kyslé aj bázické skupiny, napr. aminokyseliny, proteíny, peptidy) využíva zastavenie častíc pri pohybe v jednosmernom elektrickom poli, ak sa dostanú na miesto s hodnotou pH rovnajúcou sa hodnote ich izoelektrického bodu. Pri separácii zmesi amfolytov s rôznou hodnotou izoelektrického bodu sa každý zastaví na inom mieste v sústave, a tým dochádza k ich oddeleniu. Gradient pH možno vytvoriť elektrolýzou zmesi amfotérnych zlúčenín, pričom sa vytvorí akoby stacionárny stav, v ktorom sú amfolyty usporiadané podľa narastajúcej hodnoty izoelektrického bodu od najnižšej (pri anódovej komôrke so silnou kyselinou) po najvyššiu hodnotu (pri katódovej komôrke so silnou bázou). Využívajú sa pritom syntetické zmesi amfotérnych látok, napr. alifatické polyaminopolykarboxylové zlúčeniny s relatívnou molekulovou hmotnosťou 300 – 1 000 s hodnotou izoelektrického bodu pI 3 – 10. Izoelektrická fokusácia sa väčšinou robí v polyakrylamidovom géli alebo v tenkých agarózových vrstvách; používa sa rovnaké zariadenie ako pri zónovej elektroforéze. Najprv sa uskutoční prefokusácia (bez vzorky), ktorou sa vytvára gradient pH, a následne analytická izoelektrická fokusácia so vzorkou. Izoelektrická fokusácia je veľmi presná metóda, napr. umožňuje oddeliť proteíny s rozdielom ich izoelektrických bodov 0,01.