klonovanie

klonovanie —

1. vznik, resp. získavanie geneticky identických jedincov (→ klon) nepohlavným rozmnožovaním (vegetatívne rozmnožovanie jednobunkových organizmov – priečne alebo pozdĺžne delenie bunky, delenie rozpadom, pučanie; rastlín – vegetatívne poplazy, cibule, vrúble, púčiky; nižších živočíchov – delenie, pučanie, polyembryónia alebo metódami molekulárnej biológie, genetiky a biotechnológií). Klonovanie jednobunkových organizmov (baktérií, vírusov) je založené na ich schopnosti deliť sa vo vhodnom kultivačnom médiu, využíva sa napr. v hybridómovej technológii na prípravu monoklonových protilátok. Pri cielenom klonovaní rastlín sa kúsky izolovaného rastlinného pletiva, prípadne jedna bunka v pletivovej kultúre, in vitro nechajú rásť na hmotu nediferencovaných buniek (→ kalus) alebo sa z nich priamo vytvoria mnohopočetné výhonky a následne navodením diferenciácie buniek somatickou embryogenézou alebo organogenézou sa získajú klony.

Pri experimentálnom klonovaní cicavcov existujú na vytvorenie klonovaných jedincov štyri techniky: 1. bisekcia embrya (pužívala sa v 70. rokoch 20. stor.), 2. prenos jadra embryonálnej bunky (v 80. rokoch 20. stor.), 3. prenos jadra somatickej bunky (vytvorenie zygoty odobratím jadra zo somatickej – diferencovanej bunky a jeho prenos do neoplodneného vajíčka, z ktorého bolo predtým odstránené jadro), 4. technika HMC (angl. Handmade Cloning; bisekcia časti oocytu, zvyšok oocytu bez deoxyribonukleovej kyseliny je použitý na fúziu so somatickou bunkou, ktorá má jadro).

Klony od jedného darcu sú geneticky identické, môžu však byť epigeneticky odlišné. Klonovanie cicavcov spočiatku slúžilo na testovanie hypotéz mechanizmov bunkovej diferenciácie (blastoméry zo skorých 2-, 4- alebo 8-bunkových embrií boli prenesené do recipientných samíc; → embryotransfer); prvé experimenty 1942 na potkaních embryách boli neúspešné. Významný prelom nastal 1983, keď bolo prenesené donorové jadro pomocou bunkovej fúzie, neskôr sa k bunkovej fúzii pridal prenos prvojadra do myších recipientných embryí. R. 1996 škótski vedci vytvorili prvý klon, ovcu Dolly, prenosom a reprogramovaním plne diferencovanej somatickej bunky z mliečnej žľazy 6-ročnej ovce. Postupne boli vytvorené klony rôznych cicavcov, napr. myší a transgénnych teliat (1998), prasiatok (2000), králikov (2002), potkanov, mačky a koňa (2003), fretky (2004), psa a vlka (2005), chimerických králikov (2006).

Klonované jedince môžu byť využité na základný výskum, tvorbu GMO jedincov (→ geneticky modifikovaný organizmus), produkciu terapeutických buniek (embryonálne kmeňové bunky), xenotransplantácie, zachovanie genetických zdrojov a na selekciu. Výskum v tejto oblasti je zameraný predovšetkým na klonovanie hospodárskych zvierat (na výber techník na prenos jadra, aby sa pri klonovaných jedincoch eliminovali defekty a abnormality). Klonovanie ľudských embryí na akékoľvek účely je v EÚ (a teda aj na Slovensku) zakázané; výnimkou je Spojené kráľovstvo, kde je povolené klonovanie na terapeutické účely s individuálnym povolením. V súvislosti s génovými manipuláciami (→ génové inžinierstvo) sa rozvíja i bioetika, ktorá sa zaoberá aj otázkami klonovania. Perspektívy klonovania cicavcov sú vo vývoji malého počtu plemenných a transgénnych zvierat. V budúcnosti sa predpokladá využitie klonovania ľudských kmeňových buniek v humánnej medicíne pri liečbe rôznych ochorení;

2. klonovanie deoxyribonukleovej kyseliny (DNA), klonovanie génov, molekulárne klonovanie — príprava súboru identických molekúl, fragmentov alebo úsekov DNA (klonov DNA) namnožením rekombinantných molekúl DNA prostredníctvom hostiteľských buniek. Zahŕňa tri základné kroky: prípravu rekombinantnej molekuly DNA, jej prenos do hostiteľských buniek a napokon selekciu a analýzu klonov obsahujúcich rekombinantnú DNA.

Rekombinantná molekula DNA sa pripraví spojením úseku DNA (aj cudzorodá DNA, klonovaná DNA, inzert; získa sa extrakciou z organického materiálu alebo špecifickým vyštiepením z dlhšieho fragmentu DNA pomocou enzýmov reštrikčných endonukleáz, prípadne sa pripraví synteticky ) s klonovacím vektorom (najčastejšie plazmidom). V nasledujúcom kroku sa rekombinantná molekula DNA transformáciou alebo elektroporáciou prostredníctvom vírusu, resp. bakteriofágu (→ transdukcia) alebo eukaryontných buniek (→ transfekcia) prenesie do hostiteľských, najčastejšie bakteriálnych buniek kmeňa Escherichia coli. V treťom kroku sa metódami molekulárnej biológie vyselektujú bunky, ktoré obsahujú rekombinantnú DNA, oddelia sa od buniek, ktoré obsahujú len klonovací vektor (plazmid) bez cudzorodej DNA (→ selekcia rekombinantov), a po namnožení sa vyhľadá klon DNA so žiadanou sekvenciou nukleotidov. Týmto postupom sa z jednej kópie daného fragmentu DNA pripraví veľké množstvo identických kópií pôvodne klonovanej DNA. Klonovanie DNA sa v praxi využíva v biotechnológiách, ktoré umožňujú pomocou mikroorganizmov vyrábať látky, ktoré mikroorganizmy prirodzene neprodukujú (napr. rekombinantný inzulín, interferón, vakcíny proti hepatitíde B, rastový hormón; → génové inžinierstvo).